Diplômée de Sciences-Po Bordeaux et de l’Institut Régional d’Administration de Lille, elle débute sa carrière en 1987 à la Caisse des Dépôts, comme jeune directrice départementale.

Entre 1993 et 2007, elle exerce plusieurs fonctions de premier plan en cabinet ministériel : directrice-adjointe puis directrice du cabinet du ministre des relations avec le parlement et porte-parole du gouvernement puis conseillère parlementaire du Premier ministre Dominique de Villepin. Florence Berthout a également été collaboratrice du Président du Sénat, Christian Poncelet.

A 44 ans, elle prend la direction générale de La Villette, plus grand parc culturel d’Europe et «véritable laboratoire de la démocratisation culturelle».

Conseillère de Paris depuis 2001 et conseillère régionale d’Ile-de-France entre 2004 et 2010, Florence Berthout s’est particulièrement impliquée sur les grands dossiers métropolitains du transport et de l’urbanisme, comme administratrice du STIF (syndicat des transports d’Ile-de-France), et de l’APUR (atelier parisien d’urbanisme).

Le 13 avril 2014, Florence Berthout est élue Maire du Ve arrondissement, succédant ainsi à Jean Tiberi.

Le 13 décembre 2015 Florence BERTHOUT est élue Conseillère régionale d’Ile-de-France.